食用菌的分离可以分为孢子分离法、组织分离法和基内分离法。

孢子分离是利用毛木耳能产生有性孢子或无性孢子萌发后能产生菌丝，培养成菌种的分离方法，由于孢子个体差异较大，有自然分离的现象，后代变异可能性也较大，通过筛选，可能产生新的菌种。

孢子分离法：孢子分离法一般采用钩悬法，孢子散落后在适宜的培养基条件下培养。

组织分离法：当毛木耳子实体已成熟，耳片富有弹性时，选用耳丛基部耳肉较厚的组织，用手将菌肉撕开，用刀刮取菌内转接到试管中培养即可。

无论孢子分离或组织分离，都应经过出菇或试验后才能用于生产。

基内分离：一般将培养基质作为分离材料，这种方法只适宜于不易采集到子实体的情况下才应用。而且采用的基质须经过无菌处理，才能应用，所以一般不常用。